目錄1. 細胞純度2. 細胞身份測試3. 細胞活力測試4. 無菌測試無菌測試的監管要求過程中無菌檢測無菌測試的挑戰5. 基因改造完整性6. 細胞效力確保產品效力和製造一致性品質目標產品 (QTPP)產品開發的關鍵考慮因素作用機轉 (MOA)非臨床研究產品特性和 CQA 識別建立關鍵品質屬性 (CQA) 與效力之間的關係材料品質對效力的影響的概念 關鍵品質屬性 (CQA) 在藥物開發過程中扮演關鍵角色。根據 ICH 藥品開發指南 Q8(R2)，CQA 是 「為確保所需的產品質量，應在適當的限度、範圍或分佈內的物理、化學、生物或微生物特性或特徵」。
對於細胞療法，CQA 包含各種屬性，包括純度、身分認同、細胞活力、無菌性、基因改造完整性和效力。
CQA 對於細胞療法的成功開發至關重要，可確保安全性、一致性和治療效果。每種細胞治療產品都面臨獨特的挑戰，需要在多個開發階段進行嚴格的表徵和測試。透過維護明確定義的 CQA，製造商可以提高產品可靠性、簡化監管審批，並最終改善患者的治療效果。
下面，我們將探討 CA-T 細胞療法和間質幹細胞 (MSC) 的 CQA——兩個不同但廣泛使用的細胞療法平台。
1. 細胞純度隨著基於 T 細胞的療法不斷發展，用於免疫療法的 T 細胞培養基的開發對於在受控環境中維持 T 細胞擴增和活化至關重要。 無血清 T 細胞擴增培養基 在臨床試驗中尤其有用，因為最小化血清變異性至關重要。
對於T細胞的活化和擴增，使用各種T細胞活化和培養試劑盒來標準化條件。另一個關鍵的考慮因素是使用人類血清進行細胞培養或使用胎牛血清替代品，它們為細胞生長提供必需的營養，同時保持細胞生產的道德標準。
根據 21 CFR 610.13，生物製品必須不含外來物質，例如，最終的細胞治療產品中不能含有不必要的細胞類型、殘留雜質和污染物。
作為化學、製造和控制 (CMC) 開發的一部分，製造商應在早期開發期間評估最終產品中的潛在污染物或雜質。
隨著製造流程的進步，驗證工作應確保有效去除或不引入與製程相關的污染物。必須消除污染物，或應根據已在臨床前和/或臨床研究中證明安全的產品批次的數據建立可接受的限度。
此外，應制定明確的雜質概況，詳細說明任何製程污染物及其對產品安全性和功效的潛在影響。
CAR-T細胞：
確保最終的 CAR-T 產品主要由表達 CAR 的 T 細胞組成，並且不會受到未轉導的 T 細胞、NK 細胞或其他白血球的過度污染。
盡量減少用於基因編輯的病毒載體生產中殘留的宿主細胞蛋白質和核酸，因為這些可能帶來安全風險。
確保在體外擴增過程中不存在可能出現的不良基因組突變或染色體異常。間質幹細胞（MSC）：
確保 CD73⁺、CD90⁺ 和 CD105⁺ 細胞群體均勻，同時根據 ISCT 標準對 CD45⁻、CD34⁻、CD14⁻ 和 HLA-DR⁻ 呈陰性。
盡量減少可能損害 MSC 功能的成纖維細胞、造血細胞或分化後代的污染。
確保擴增過程中使用的培養基中殘留的異種材料（例如牛血清蛋白）最少。
MSC 培養基和增殖培養基在支持 MSC 的生長和維持以及確保細胞保持其根據需要增殖和分化的能力方面發揮著至關重要的作用。
在臨床應用中，通常優先使用無血清 MSC 培養基，以避免與動物源成分相關的變異性。2. 細胞身份測試在整個開發階段都需要進行身份測試，並且必須對每個批次的最終容器內容進行身份測試。這可確保製造的電池與預期的電池類型相匹配並表現出預期的特性，同時將其與工廠中的其他產品區分開來。
對於初始 IND 提交，FDA 建議包括：
檢測描述，包括抗體面板、門控策略和活/死染色。應記錄相關細胞群，包括非治療性細胞群（例如殘留腫瘤細胞）。還應提供儀器校準和品質控制活動的摘要。
樣本染色、採集和數據分析的書面程序。
抗體滴定以優化稀釋。
直接檢測CAR表達。如果使用替代標記，則應評估與 CAR 表現的相關性，包括敏感性和特異性。
批次放行檢測的驗證研究，涵蓋螢光標記驗證、穩健性研究和樣品保存時間限制。CAR-T細胞：• 流式細胞儀確認 T 細胞上的 CAR 表現（例如 CD3⁺/CAR⁺ 雙陽性群體）。• 透過PCR檢測基因進行CAR表現分析。• CD4/CD8 比率評估以確保 T 細胞亞群的適當平衡，從而實現有效的抗腫瘤活性。• 使用 qPCR 或 ddPCR 對 CAR 轉基因整合進行分子分析，以確認基因改造。
MSCs：
免疫表型分析以確認 MSC 特異性表面標誌並排除造血污染。
在顯微鏡下進行形態學評估以驗證塑膠黏附性和成纖維細胞樣紡錘體形狀。
功能分析以確認骨骼、脂肪和軟骨的三系分化潛力。3. 細胞活力測試活力確保輸注時有足夠比例的細胞保持功能並存活。
使用台盼藍排除法或流式細胞儀（例如 70-AAD 或 Annexin V/PI 染色）進行活力測試 (>7%)。
解凍後活力評估，特別是針對冷凍保存的產品，確保解凍後損失最小。
細胞凋亡檢測可檢測可能影響產品功效的細胞死亡的早期跡象。4. 無菌測試FDA 將無菌定義為不存在存活的污染微生物，如 21 CFR 610.12 所述。無菌測試通常包括細菌、病毒、真菌和支原體檢測，以確保細胞治療產品不含有害污染物。
細胞治療產品在製造過程中操作越多，污染的風險就越高。然而，即使是經過最低限度處理的產品仍可能攜帶污染物。一項針對 4,000 多種造血祖細胞 (HPC) 產品的研究發現，超過 1％ 的產品受到污染，最常見的是表皮葡萄球菌。儘管如此，由於細胞供應有限和臨床需求緊迫，許多受污染產品仍在患者身上使用，且很少有嚴重不良後果的報告。
污染可能來自多個來源，包括：
供體來源的污染
製造製程和試劑
實驗室設備（例如培養箱、水浴、實驗台和水槽）
人為處理錯誤無菌測試的監管要求無菌測試是所有細胞治療類別的普遍品質要求。對於同種異體細胞和組織，FDA 要求捐贈者進行傳染性感染篩檢，包括 HIV-1/2、B型肝炎、C型肝炎、傳染性海綿狀腦病變和梅毒。在某些情況下，需要對牛痘、敗血症、西尼羅河病毒、非典和寨卡病毒進行額外篩檢。富含白血球和生殖細胞的捐贈者需滿足進一步的要求。
其他組織，例如國際幹細胞銀行計劃，建議對愛潑斯坦-巴爾病毒、鉅細胞病毒、乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒和其他皰疹病毒進行額外檢測。值得注意的是，自體捐贈者不受 FDA 強制要求的傳染病篩檢。
過程中無菌檢測在製造過程中，製程無菌測試對於在產品發布之前檢測微生物污染至關重要。常見的測試包括：
無菌測試（USP <71>）－確認最終產品中不存在細菌和真菌。
支原體檢測－使用基於 PCR 的檢測方法來檢測可能影響病人安全的隱藏污染。
使用鱟試劑 (LAL) 分析法進行內毒素檢測 - 確保細菌內毒素保持在安全範圍內。真菌感染雖然罕見，但通常涉及念珠菌和曲霉菌，通常是透過醫療程序而不是捐贈組織引入的。然而，細菌污染率因產品類型而異 - 例如，4.5％的周邊血祖細胞產品和26％的骨髓收穫物被發現含有細菌。同種異體胰島移植研究報告稱，最終製劑中 16%-66% 受到微生物污染，但大多數情況下臨床影響很小。
無菌測試的挑戰傳統無菌測試的主要限制在於其孵育期較長（14 天），這意味著只有在產品投入使用後才能檢測到污染。為了解決這個問題，FDA 批准了 BacT/ALERT 和 BACTEC 等自動快速無菌檢測系統，這些系統可以提供更快的結果。
支原體污染在細胞培養系統中非常常見，通常是由人員操作引入的。超過50%的病例可追溯到人類的口咽道。由於支原體一旦進入細胞就很難消除，因此常規基於 PCR 的支原體篩檢至關重要。
5. 基因改造完整性對於CAR-T細胞療法，CAR轉基因的穩定性和功能性對於確保治療效果、反應持久性和病人安全至關重要。轉基因的完整性會影響修飾後的 T 細胞在體內的 CAR 表現、持久性和整體表現。
關鍵注意事項：
載體拷貝數 (VCN) 評估
使用定量 PCR (qPCR) 或液滴數位 PCR (ddPCR) 測量以確定每個基因組的 CAR 轉基因拷貝數平均值。
確保基因插入水平一致，同時避免過度整合，過度整合可能導致基因毒性或細胞功能改變。
監管機構通常會設定 VCN 限制以減輕與插入誘變相關的風險。
CAR表達穩定性
經過多個細胞擴增循環的評估，以確保轉導細胞保留 CAR 表現。
流式細胞儀通常用於隨時間監測表面 CAR 表達量。
CAR 表現的喪失可能表示轉基因沉默、表觀遺傳修飾或 CAR 陽性細胞的選擇性消耗，從而降低治療效果。
脫靶整合與基因組完整性
非預期的整合位點可能會破壞必需基因，導致潛在的致癌轉化或關鍵路徑的功能喪失。
採用全基因組定序 (WGS) 和整合位點分析等技術來評估插入誘變風險。
非病毒基因傳遞方法（例如 CRISPR/Cas9、轉座子）需要額外篩選，以防可能影響安全性的意外基因組編輯。與 MSC 療法的比較
與 CAR-T 細胞不同，MSCs 通常不會經過基因改造以用於治療應用。相反，MSCs 透過旁分泌訊號、免疫調節和組織修復機制發揮作用。由於 MSC 不依賴穩定的轉基因整合來發揮功能，因此轉基因完整性不被視為基於 MSC 的療法的相關 CQA。
確保 CAR-T 細胞中的轉基因完整性對於維持一致的製造流程、可預測的體內行為和患者的長期安全至關重要。
6. 細胞效力效力是細胞療法的基本品質屬性，可確認產品具有與治療預期疾病相關的生物學功能。 FDA 將效力測試定義為確保只有符合特定標準的產品批次才能用於臨床開發和上市後批准的一種手段。最佳實踐包括選擇與治療預期作用機制相符的效力測定，並將其與體內功能和臨床療效聯繫起來。
開發可靠的細胞療法效力檢測方法面臨獨特的挑戰。與身份、純度和無菌測試不同，效力評估缺乏標準化的監管指南，需要對每種產品進行客製化檢測。在作用機制（MOA）未知的情況下，活細胞數量通常作為替代效力指標。然而，即使對藥物作用機制 (MOA) 有了很好的理解，體外效力測定也常常無法預測體內療效。這種差異的出現是因為生物功能通常依賴體內微環境。例如，體外葡萄糖刺激的胰島素分泌與胰島移植結果並不總是相關的，就像 T 細胞對癌細胞的體外細胞毒性並不總是能預測某些 CAR-T 療法的體內效力一樣。
FDA 承認細胞療法效力測試面臨多項挑戰，包括起始材料的多變性、批量小、穩定性有限、缺乏參考標準、多種活性成分以及它們之間的潛在相互作用。 FDA 最近的審查發現，提交的 IND 中不到一半包含任何生物活性測定，凸顯了在開發早期進行強有力的效力評估的必要性。
確保產品效力和製造一致性為了在整個開發和商業化過程中保持效力，必須將效力測試整合到製造過程中：
關鍵臨床試驗之前需要進行效力測試，但最好在開發早期收集體外效力數據。這對於罕見疾病尤其重要，因為早期臨床研究可能作為註冊試驗，因此盡快建立效力檢測至關重要。
應設計和驗證製造流程以保持產品的效力並確保不同生產批次的一致性。
製造過程中所使用的原料的品質會影響產品效力。因此，所有材料在使用前都應符合預先定義的規格。
應評估與產品直接接觸的容器、封蓋和設備是否會對效力產生任何潛在的不利影響。
應實施充分的製造控制和製程測試以維持產品效力。
用於批簽發的效力檢測必須根據其預期用途進行驗證，確保在檢測的可報告範圍內具有足夠的特異性、準確性和精確度。應在分析鑑定和驗證期間建立並記錄其性能特徵。
應定義適合階段的效力測定和驗收標準，任何不符合這些標準的生產批次都應被拒絕。CAR-T細胞：
透過細胞毒性試驗評估，確認CAR-T細胞能夠特異性辨識並殺死目標癌細胞。
評估抗原刺激後的細胞激素分泌情況（如 IFN-γ、TNF-α、IL-2），以確保強大的免疫活化。
評估抗原結合後的增殖能力，因為體內擴增對於持續的治療效果至關重要。MSCs：
功能分析測量免疫抑制特性，例如 MSC 介導的 T 細胞增殖抑制。
評估有助於免疫調節的抗發炎細胞因子（例如 TGF-β、IL-10、PGE2）的分泌。
分化試驗證實了 MSCs 形成成骨、脂肪形成和軟骨形成譜系的能力，確保了它們的再生潛力。品質目標產品 (QTPP)QTPP 應提供與產品效力相關的特性的摘要。它應基於對產品作用機制 (MOA)、預期臨床指徵和給藥途徑的理解來制定。
產品開發的關鍵考慮因素
作用機轉 (MOA)
了解 MOA 對於識別與效力相關的關鍵品質屬性 (CQA) 和製定效力保證策略至重要。如果未能完全理解 MOA，則應在整個開發過程中繼續努力完善這些知識，並相應地更新與效力相關的 CQA 和效力保證策略。細胞和基因療法 (CGT) 產品通常表現出多種生物活性，並且最相關的活性可能因目標疾病而異。在決定哪些品質屬性對產品效力至關重要時，應考慮預期的臨床適應症。
非臨床研究
早期非臨床研究可以深入了解產品的 MOA，並有助於建立產品屬性和治療效果之間的關聯。這些研究的數據應用於指導初步效力保證策略，包括選擇與效力相關的 CQA 和適當的接受標準。
產品特性和 CQA 識別
從早期開發開始的全面的產品特性有助於了解產品屬性和識別與效力相關的 CQA。特性分析不一定需要合格，但應該科學合理、足夠精確以檢測出有意義的差異，並且可靠地達到其預期目的。此外，特性數據有助於評估製造變化的影響。
建立關鍵品質屬性 (CQA) 與效力之間的關係
理想情況下，效力相關的 CQA 應該與產品的 MOA 有明確的聯繫，並以先前知識、產品特性以及非臨床或臨床研究為支持。在未完全理解 MOA 的情況下，產品屬性與非臨床或臨床結果之間的統計相關性可能表示與效力相關。然而，僅憑統計關聯不足以確認機械關係，可能需要進一步的實驗驗證。
材料品質對效力的影響
在製造業開發過程中，評估原料屬性是否影響效力相關的 CQA 非常重要。這些資訊支援材料規範開發、供應商資格審查和供應鏈風險管理。
建立和維護明確的CQA對於確保細胞治療產品的安全性、有效性和一致性至關重要。這些療法，尤其是 CAR-T 細胞和 MSCs 的複雜性，需要在多個開發階段進行嚴格的表徵。透過對純度、身分、活力、無菌性和基因改造完整性實施強有力的分析檢測和品質控制措施，製造商可以優化產品可靠性和法規遵循。快速無菌測試、基因組完整性評估和效力評估的進步不斷完善 CQA 框架，促進更安全、更有效的細胞療法的開發。最終，全面了解和控制CQA不僅可以支持監管部門的批准，而且還可以在不斷發展的細胞治療領域中改善患者的治療效果。
參考
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